本發(fā)明涉及一種臨床治療藥物血藥濃度監(jiān)測(cè)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記甲氨蝶呤內(nèi)標(biāo)試劑的制備方法，屬于臨床治療藥物血藥濃度監(jiān)測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)領(lǐng)域。本發(fā)明以穩(wěn)定同位素標(biāo)記對(duì)甲苯磺酸甲酯為原料，經(jīng)加成、縮合、水解，最后分離純化得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記甲氨蝶呤。本發(fā)明工藝路線具有合成所需原料簡(jiǎn)單易得、反應(yīng)條件溫和、不使用劇毒甲基化試劑、最終產(chǎn)物總收率高且易分離提純。最終產(chǎn)物穩(wěn)定同位素標(biāo)記甲氨蝶呤的化學(xué)純度可達(dá)99％以上，同位素豐度可達(dá)99％以上。本制備方法所制得的穩(wěn)定同位素標(biāo)記甲氨蝶呤內(nèi)標(biāo)試劑能滿足臨床治療藥物血藥濃度監(jiān)測(cè)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法所需穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)試劑的技術(shù)要求。