本申請(qǐng)公開(kāi)了一種用于Small?RNA的測(cè)序方法、測(cè)序試劑和應(yīng)用。本申請(qǐng)用于Small?RNA的測(cè)序方法，包括在對(duì)混合樣本的環(huán)狀文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序時(shí)，向引物溶液中添加正常測(cè)序引物和阻斷測(cè)序引物，采用混合引物進(jìn)行測(cè)序；阻斷測(cè)序引物由正常測(cè)序引物3’末端羥基經(jīng)化學(xué)修飾而成。本申請(qǐng)的測(cè)序方法，通過(guò)添加阻斷測(cè)序引物，使得混合樣本環(huán)狀文庫(kù)Small?RNA測(cè)序得以實(shí)現(xiàn)，并能有效的保障標(biāo)簽序列的測(cè)序，進(jìn)而提高了數(shù)據(jù)利用率，得到良好的拆分率。本申請(qǐng)的Small?RNA測(cè)序方法和測(cè)序試劑，為Small?RNA混合樣本測(cè)序提供了一種新的思路和方案，解決了目前的環(huán)狀文庫(kù)Small?RNA測(cè)序的測(cè)序資源浪費(fèi)等問(wèn)題。