一種利福霉素S的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：1）以利福霉素S-Na為起始物，乙醇和濃硫酸為溶劑，在酸性條件下攪拌1.5~2h，點板，直至無利福霉素S-Na斑點；2）將步驟1）所得的混合物降至5℃，停止攪拌，靜置2h以上，然后離心得到固體混合物以及母液，將利福霉素S粗品打松，酸洗、水洗后得到利福霉素S粗品；3）將步驟2）所得的利福霉素S粗品精制，即得利福霉素S精品；4）將步驟2）所得母液蒸餾回收乙醇用于步驟1）。滿足了生產(chǎn)工藝簡單、低耗、可回收、三廢少的要求。