本發(fā)明涉及分析檢測技術領域，具體涉及多種維生素D代謝物聯合檢測方法及其檢測試劑盒和應用。本發(fā)明提供的檢測維生素D代謝物的方法為采用液相色譜串聯質譜法進行檢測，其中，液相色譜的流動相包括流動相A和流動相B，所述流動相A為含有醋酸鋰的水溶液，所述流動相B為含有醋酸鋰的甲醇溶液。該方法可實現25OHD₃、25OHD₂、1,25(OH)₂D₃、1,25(OH)₂D₂、24,25(OH)₂D₃、24,25(OH)₂D₂的同時檢測，可同時區(qū)分多種同分異構體和干擾；具有較高的靈敏度和特異性，且不需要衍生化處理，節(jié)約樣本前處理時間，為維生素D代謝物的高通量檢測提供便利。