本發(fā)明公開的一種4?巰基尿嘧啶的雙功能標記方法及其在序列富集與單堿基分辨測序中的應(yīng)用，屬于核酸化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用了N?己?5?炔基?2?碘乙酰胺(E?IAA)對4?巰基尿嘧啶進行親核取代反應(yīng)從而實現(xiàn)雙功能的標記，雙功能體現(xiàn)在：末端的炔基可以與帶有生物素的疊氮基團在溫和的條件下進行高效交聯(lián)，實現(xiàn)了對含有4?巰基尿嘧啶的序列富集，近端的N?H鍵可以改變4?巰基尿嘧啶原本的堿基氫鍵配對模式，在其位置上產(chǎn)生T到C的突變，從而實現(xiàn)對4?巰基尿嘧啶以及核酸衍生物的單堿基分辨。該雙功能的標記反應(yīng)效率高，且具有良好的生物兼容性。