本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種HPLC法分離測定帕司煙肼及其相關(guān)雜質(zhì)的方法。所述方法中采用的色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用流動相A和流動相B進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測；所述相關(guān)物質(zhì)包括異煙肼、對氨基水楊酸和相關(guān)雜質(zhì)；所述相關(guān)雜質(zhì)為A?E中的一種或多種；所述流動相A為磷酸鹽緩沖液，所述的流動相B為甲醇。本發(fā)明的方法能同時分離測定帕司煙肼中異煙肼、對氨基水楊酸和相關(guān)雜質(zhì)A?E，與現(xiàn)有技術(shù)相比，提高了分離檢測的效率；能更精準(zhǔn)的確保帕司煙肼原料藥及其制劑的質(zhì)量可控，并最終確定產(chǎn)品的安全有效。