本發(fā)明公開了一種特異性檢測銅離子和硫離子的多肽、化學熒光傳感器及其制備方法與應用。所述的特異性檢測銅離子和硫離子的多肽的氨基酸序列為：HEFH。所述的化學熒光傳感器是由所述的特異性檢測銅離子和硫離子的多肽與異硫氰酸熒光素鏈接而成，所述的異硫氰酸熒光素與所述多肽中谷氨酸一側的組氨酸相連。所述的多肽裂解前加入六氨基己酸，在三乙胺存在下讓異硫氰酸熒光素與六氨基己酸反應3~5h得到目標物化學熒光傳感器。所述的化學熒光傳感器在銅離子檢測中的應用為所述的化學熒光傳感器在硫離子檢測中的應用，所述的化學熒光傳感器在細胞毒性檢測中的應用。本發(fā)明基于多肽的化學熒光傳感器選擇性好，靈敏度高干擾小，檢測限低。