1.本發(fā)明涉及高分子材料的設(shè)計、加工、制作和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置及其制備方法。

背景技術(shù)：

2.外泌體是細胞經(jīng)過“內(nèi)吞

?

融合

?

外排”等一系列調(diào)整過程而形成的細胞外納米級囊泡。其在人體內(nèi)分布廣泛，人體的尿液、汗液、血液、乳汁等均含有外泌體。近年來的研究表明，外泌體會作為細胞之間物質(zhì)代謝和信號傳遞的途徑，且既參與疾病的發(fā)生，又參與免疫調(diào)節(jié)。外泌體生成機制表明，通過分析外泌體的組分，可以幫助識別其來源的細胞類型。于是外泌體可作為液體活檢的重要生物標(biāo)志物，用于癌癥早期臨床診斷；也可作為一些疾病的預(yù)后標(biāo)志物，用來評估藥物療效或監(jiān)控病情進展。此外，一些研究表明，小鼠體內(nèi)外泌體的免疫原性比脂質(zhì)體低，穩(wěn)定性高，因此可通過修飾處理作為潛在的藥物載體；也有研究表明，干細胞外泌體本身就具有促進再生、抑制凋亡、調(diào)節(jié)免疫等療效，因此外泌體在一些神經(jīng)退行性疾病中也有著廣泛的應(yīng)用前景。

3.然而，由于外泌體的尺寸小且與血液中的其他復(fù)雜物質(zhì)特征相近，高效分離外泌體極具挑戰(zhàn)性。目前，基于密度分離的超速離心法是最常用的外泌體分離方法，被譽為分離外泌體的“金標(biāo)準”。但超速離心法分離外泌體耗時長，需要大型儀器成本高，回收率與分離純度也比較低。現(xiàn)已有許多基于不同原理的其它被報道過的外泌體分離方法，如基于抗原抗體反應(yīng)的免疫分離、基于尺寸的超濾分離與尺寸排阻層析、基于親疏水性質(zhì)的聚合物沉淀分離以及各種新型的依靠流體力學(xué)的微流控方法等，各有各的優(yōu)勢與不足。

4.由于外泌體膜帶有負電荷，基于電荷的方法近年來逐漸被重視。已有使用電泳等方法使外泌體在電場中分離的報道，也有修飾聚賴氨酸到磁珠上同樣利用正負電荷相互作用分離外泌體的研究。然而，加電場的方法操作繁瑣，使用聚賴氨酸吸附的方法價格較為昂貴且不適合處理部分生物樣本，因此研究基于電荷的外泌體分離方法依然很有前景。殼聚糖是一種帶有氨基的天然生物活性化合物，在酸性條件下氨基與氫離子結(jié)合使殼聚糖帶正電。由于殼聚糖具有免疫增強、抗菌、抗氧化和傷口愈合等多種生物活性，且它無毒、可生物降解、生物相容性高、成本低廉，導(dǎo)致了其廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。利用殼聚糖與外泌體的正負電荷相互作用達到外泌體的分離與富集，有望為我們在外泌體研究發(fā)展及疾病檢測等方面提供一個新思路。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

5.本發(fā)明的目的是提供一種基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置，以解決以往外泌體分離與檢測過程中存在的操作步驟繁瑣復(fù)雜、消耗大量試劑、成本高昂等局限。

6.本發(fā)明提供了一種基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置，該裝置由內(nèi)外兩部分組成，其中：外部為帶有通道的反應(yīng)池，內(nèi)部為吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料；

7.所述帶有通道的反應(yīng)池設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：

8.——反應(yīng)池底部平板：位于整個反應(yīng)池的底部；

9.——反應(yīng)池上層板：位于反應(yīng)池底部平板之上；

10.所述反應(yīng)池上層板設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：

11.——反應(yīng)池上層板樣品分離通道：位于反應(yīng)池上層板上；

12.——反應(yīng)池上層板樣品出入口：位于反應(yīng)池上層板樣品分離通道兩端；

13.所述吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料位于反應(yīng)池上層板樣品分離通道內(nèi)部，由反應(yīng)池上層板樣品出入口置入，位于反應(yīng)池底部平板上方。

14.所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置還滿足下述要求之一或其組合：

15.其一，所述帶有通道的反應(yīng)池的材料為聚甲基丙烯酸甲酯，反應(yīng)池底部平板高度為0.1

?

5cm，反應(yīng)池上層板高度為0.1

?

5cm；反應(yīng)池底部平板和反應(yīng)池上層板長度相同，均為5

?

20cm，寬度相同，均為2

?

15cm；

16.其二，所述反應(yīng)池上層板樣品分離通道高度為0.1

?

3cm，長度為2

?

10cm，寬度為0.5

?

2cm；通道個數(shù)為1

?

20個；

17.其三，所述吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料是長方體結(jié)構(gòu)，材料邊長為0.1

?

1cm。

18.所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備還滿足下述步驟：

19.(1)所述反應(yīng)池底部平板與反應(yīng)池上層板是采用聚甲基丙烯酸甲酯加工得到的；

20.(2)所述反應(yīng)池底部平板與反應(yīng)池上層板通過粘接劑粘連到一起，或打孔后用螺絲固定得到帶有通道的反應(yīng)池。

21.所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備方法還滿足下述步驟：

22.(1)在殼聚糖溶液中加入致孔劑與交聯(lián)劑得到殼聚糖凝膠，凍干殼聚糖凝膠得到殼聚糖多孔吸附材料；

23.(2)將殼聚糖多孔吸附材料切割后放入帶有通道的反應(yīng)池中得到基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置；

24.所述的致孔劑為二甲基亞砜，所述的交聯(lián)劑為甲醛、戊二醛、京尼平中的一種。

25.所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的殼聚糖多孔吸附材料制備方法還滿足下述步驟：

26.(1)配置質(zhì)量分數(shù)為1％

?

10％的殼聚糖水溶液，在殼聚糖水溶液中加入1％的冰乙酸和1％

?

10％的二甲基亞砜，制備得到殼聚糖溶液；

27.(2)將得到的殼聚糖溶液置于4℃環(huán)境下3

?

12h；

28.(3)配置等體積的0.1％

?

0.5％的戊二醛溶液，與殼聚糖溶液攪拌混合，抽真空10

?

60min至無氣泡，置于

?

30℃冰凍3

?

12h；

29.(4)將冰凍后的材料用0.5％

?

2％的硼氫化鈉溶液清洗至變白色，再用水清洗至無氣泡產(chǎn)生；

30.(5)將得到的殼聚糖材料置于

?

30℃環(huán)境下2

?

12h，再轉(zhuǎn)移到

?

80℃環(huán)境下2

?

12h使其徹底冰凍，然后用冷凍干燥機凍干1

?

3天。取出后切割成所需尺寸，得到基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的殼聚糖多孔吸附材料。

31.本發(fā)明所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的用途說明：該裝置可

應(yīng)用于不同樣本(培養(yǎng)基、血液、尿液、唾液等)中外泌體的分離與富集。

32.本發(fā)明的優(yōu)點：

33.1、本發(fā)明選用殼聚糖對外泌體進行捕獲富集，是一種無標(biāo)記的外泌體富集方式，可以實現(xiàn)對樣本中所有外泌體的富集，分離效率高。

34.2、本發(fā)明使用價格低廉的生物材料殼聚糖作為吸附材料，大大降低了外泌體的分離成本。

35.3、本發(fā)明通過向通道中直接加樣，將裝置放置在搖床上搖擺一定時間即可分離外泌體，操作簡單，耗時短。

36.4、本發(fā)明在裝置的通道中實現(xiàn)外泌體的分離，通過減小通道尺寸減小反應(yīng)體積，可以實現(xiàn)珍稀樣本中外泌體的富集。

附圖說明

37.為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

38.圖1為基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的俯視圖簡圖；

39.圖2為基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的側(cè)視圖簡圖；

40.圖3為殼聚糖多孔吸附材料的實物圖；

41.圖4為殼聚糖多孔吸附材料的電鏡表征圖；

42.其中：1為反應(yīng)池上層板樣品出入口；2為殼聚糖多孔吸附材料；3為反應(yīng)池上層板樣品分離通道；4為反應(yīng)池上層板；5為反應(yīng)池底部平板。

具體實施方式

43.為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

44.下面對本發(fā)明實施例的基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置進行具體的說明。

45.如未特殊說明，本發(fā)明中所述的百分數(shù)均指質(zhì)量百分數(shù)。

46.實施例1

47.一種基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置，如圖1、圖2所示，該基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置由內(nèi)外兩部分組成，其中：外部為帶有通道的反應(yīng)池，內(nèi)部為吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料2；

48.所述帶有通道的反應(yīng)池設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：

49.——反應(yīng)池底部平板5：位于整個反應(yīng)池的底部；

50.——反應(yīng)池上層板4：位于整個反應(yīng)池的上層；

51.所述反應(yīng)池上層板設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：

52.——反應(yīng)池上層板樣品分離通道3：位于反應(yīng)池上層板；

53.——反應(yīng)池上層板樣品出入口1：位于整個通道兩端；

54.所述吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料2位于反應(yīng)池上層板樣品分離通道內(nèi)部，由反應(yīng)池上層板樣品出入口1置入，位于反應(yīng)池底部平板5上方。

55.所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置還滿足下述要求：

56.其一，所述帶有通道的反應(yīng)池的材料為聚甲基丙烯酸甲酯，反應(yīng)池底部平板高度為0.5cm，反應(yīng)池上層板高度為3cm；長度相同，均為15cm；寬度相同，均為10cm；

57.其二，所述反應(yīng)池上層板樣品分離通道高度為2cm；長度為7cm；寬度為1cm；通道個數(shù)為10；

58.其三，所述吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料，材料尺寸邊長為0.5cm。

59.所述殼聚糖多孔吸附材料制備方法還滿足下述步驟：

60.(1)配置50ml的4％的殼聚糖水溶液，加入1ml冰乙酸，加入5ml二甲基亞砜作為致孔劑，加水定容至100ml，攪拌均勻至無結(jié)塊；

61.(2)將得到的殼聚糖溶液置于4℃靜置8h，使溶液大體無氣泡；

62.(3)配置100ml的0.1％的戊二醛溶液，加入到殼聚糖溶液中，低溫攪拌混合，抽真空30min除氣泡，置于

?

30℃冰凍12h；

63.(4)將冰凍后的材料取出切成小塊，用1％的硼氫化鈉溶液清洗至變白色，再用水清洗至無氣泡產(chǎn)生；

64.(5)將得到的殼聚糖材料預(yù)冷：放于

?

30℃兩小時；轉(zhuǎn)移至

?

80℃再放置兩小時。使用凍干機凍干24小時。凍干結(jié)束后取出切割成0.5cm*0.5cm*0.5cm的小立方體，得到基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的殼聚糖吸附材料，外觀照片如圖3所示，電鏡觀察如圖4所示。

65.所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備還滿足下述步驟：

66.(1)所述反應(yīng)池底部平板與反應(yīng)池上層板是對聚甲基丙烯酸甲酯進行加工得到；

67.(2)所述反應(yīng)池底部平板與反應(yīng)池上層板是通過粘接劑粘連到一起或打孔后用螺絲固定得到帶有通道的反應(yīng)池。

68.所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備方法還滿足下述步驟：

69.(1)在殼聚糖溶液中加入致孔劑與交聯(lián)劑得到殼聚糖凝膠，凍干殼聚糖凝膠得到殼聚糖多孔吸附材料；

70.(2)將殼聚糖多孔吸附材料切割后放入帶有通道的反應(yīng)池中得到基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置；

71.本實施例所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的用途說明：該裝置可應(yīng)用于不同樣本(培養(yǎng)基、血液、尿液、唾液等)中外泌體的分離和富集。技術(shù)特征：

1.一種基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置，其特征在于：該基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置由內(nèi)外兩部分組成，其中：外部為帶有通道的反應(yīng)池，內(nèi)部為吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料；所述帶有通道的反應(yīng)池設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：——反應(yīng)池底部平板：位于整個反應(yīng)池的底部；——反應(yīng)池上層板：位于反應(yīng)池底部平板之上；所述反應(yīng)池上層板設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：——反應(yīng)池上層板樣品分離通道：位于反應(yīng)池上層板上；——反應(yīng)池上層板樣品出入口：位于反應(yīng)池上層板樣品分離通道兩端；所述吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料位于反應(yīng)池上層板樣品分離通道內(nèi)部，由反應(yīng)池上層板樣品出入口置入，位于反應(yīng)池底部平板上方。2.按照權(quán)利要求1所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置，其特征在于：所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置滿足下述要求之一或其組合：其一，所述帶有通道的反應(yīng)池的材料為聚甲基丙烯酸甲酯，反應(yīng)池底部平板高度為0.1

?

5cm，反應(yīng)池上層板高度為0.1

?

5cm；反應(yīng)池底部平板和反應(yīng)池上層板長度相同，均為5

?

20cm，寬度相同，均為2

?

15cm；其二，所述反應(yīng)池上層板樣品分離通道高度為0.1

?

3cm，長度為2

?

10cm，寬度為0.5

?

2cm；通道個數(shù)為1

?

20個；其三，所述吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料是長方體結(jié)構(gòu)，材料邊長為0.1

?

1cm。3.一種如權(quán)利要求1所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備方法，其特征在于：(1)所述反應(yīng)池底部平板與反應(yīng)池上層板是采用聚甲基丙烯酸甲酯加工得到的；(2)所述反應(yīng)池底部平板與反應(yīng)池上層板通過粘接劑粘連到一起，或打孔后用螺絲固定得到帶有通道的反應(yīng)池。4.按照權(quán)利要求3所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備方法，其特征在于：(1)在殼聚糖溶液中加入致孔劑與交聯(lián)劑得到殼聚糖凝膠，凍干殼聚糖凝膠得到殼聚糖多孔吸附材料；(2)將殼聚糖多孔吸附材料切割后放入帶有通道的反應(yīng)池中得到基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置。5.按照權(quán)利要求4所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備方法，所述的致孔劑為二甲基亞砜，所述的交聯(lián)劑為甲醛、戊二醛、京尼平中的一種。6.按照權(quán)利要求4或5所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖多孔吸附材料的制備方法為：(1)配置質(zhì)量分數(shù)為1％

?

10％的殼聚糖水溶液，在殼聚糖水溶液中加入1％的冰乙酸和1％

?

10％的二甲基亞砜，制備得到殼聚糖溶液；(2)將得到的殼聚糖溶液置于4℃環(huán)境下3

?

12h；(3)配置等體積的0.1％

?

0.5％的戊二醛溶液，與殼聚糖溶液攪拌混合，抽真空10

?

60min至無氣泡，置于

?

30℃冰凍3

?

12h；

(4)將冰凍后的材料用0.5％

?

2％的硼氫化鈉溶液清洗至變白色，再用水清洗至無氣泡產(chǎn)生；(5)將得到的殼聚糖材料置于

?

30℃環(huán)境下2

?

12h，再轉(zhuǎn)移到

?

80℃環(huán)境下2

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12h使其徹底冰凍，然后用冷凍干燥機凍干1

?

3天；取出后切割成所需尺寸，得到基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的殼聚糖多孔吸附材料。

技術(shù)總結(jié)

一種基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置，其構(gòu)成如下：外部為帶有通道的反應(yīng)池，內(nèi)部為用于吸附外泌體的殼聚糖多孔吸附材料；具體設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：反應(yīng)池底部平板、反應(yīng)池上層板樣品分離通道、反應(yīng)池上層板樣品出入口以及內(nèi)部的殼聚糖多孔吸附材料。所述基于正負電荷吸附原理的外泌體分離富集裝置的制備方法為：加工得到所需反應(yīng)池；凍干法得到殼聚糖多孔吸附材料置入反應(yīng)池通道中。本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單，制備操作方便，效率高，成本低，應(yīng)用范圍廣泛。廣泛。廣泛。

技術(shù)研發(fā)人員：秦建華 謝瑩瑩 陳雯雯

受保護的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所

技術(shù)研發(fā)日：2021.09.02

技術(shù)公布日：2021/12/11