本發(fā)明提供了一種從頭合成核黃素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法，涉及基因工程領(lǐng)域，所述方法包括：對來自枯草芽孢桿菌的26個合成核黃素的基因進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并化學合成，獲得了優(yōu)化后的26個基因；選擇T7啟動子和終止子控制所述優(yōu)化后的26個基因的表達，完成優(yōu)化后的26個基因原核表達單元的拼接；構(gòu)建了兩個不同復制起點和抗性標記的質(zhì)粒pBR326和pYB8895，在兩個相容質(zhì)?；A(chǔ)上組裝了核黃素從頭生物合成途徑4大功能模塊；將帶有4大功能模塊的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有T7RNAP基因的大腸桿菌，獲得了從頭合成核黃素的含枯草桿菌26個基因原核表達單元的大腸桿菌工程菌株。通過搖瓶發(fā)酵實驗來檢驗其生成核黃素的能力，最終通過HPLC質(zhì)譜法測得其核黃素產(chǎn)量達到0.55g/L。