本發(fā)明屬于提取及其分析化學技術領域，更具體的，本發(fā)明涉及一種甾體固醇類物質來源性檢測方法及其應用，所述甾體固醇類物質來源性檢測方法，包括：提取樣品中甾體固醇類物質后進行GC?C?IRMS檢測分析δ13C值。本發(fā)明開發(fā)的GC?C?IRMS檢測方法的檢測濃度線性范圍為10～13000ng/mL，在取用3mL尿樣時，對尿樣中含量較低的T、5α?diol的最低檢測濃度為10ng/mL，對尿樣中濃度較高的An和Etio的最低檢測濃度為100ng/mL。本發(fā)明所述檢測過程只需一次液相分離，無需衍生化；質譜檢測過程儀器線性良好，對各分析物進行單獨的線性模型試驗測試，得到的不確定度結果符合最新WADA2021檢測標準，分析時間短，效率高，符合大型賽事興奮劑檢測要求。