本發(fā)明屬蛋白質(zhì)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種二/三甲基化（Kme2/3）修飾肽段富集和質(zhì)譜分析的方法。本發(fā)明方法包括：對(duì)蛋白上未修飾（Kme0）或者單甲基化（Kme1）修飾的賴氨酸進(jìn)行衍生化使其帶上生物素標(biāo)記，再將蛋白酶解成肽段后，再加入親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球，通過(guò)生物素和親和素之間的高特異和高親和作用，除去Kme0/1肽段，在上清中保留Kme2/3修飾肽段，最后利用除鹽柱捕獲上清中的肽段，送入質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析Kme2/3修飾肽段。本發(fā)明方法首次實(shí)現(xiàn)對(duì)Kme2/3修飾肽段的化學(xué)富集，能顯著地提高Kme2/3修飾肽段的分析質(zhì)譜選擇性，并且具有特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、步驟簡(jiǎn)單、操作方便等特點(diǎn)。