權(quán)利要求

1.一種嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2024年12月4號，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No.32892。

2.權(quán)利要求1所述的嗜吡啶紅球菌Rho48在處理含氮雜環(huán)化合物廢水中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括將嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4組合使用，赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2024年12月4號，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No.32891。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：

將嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4分別制備成菌懸液;

然后將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液加入廢水中。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液加入廢水中包括：

所述嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液先混合后再加入廢水中;或

所述嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液分別加入廢水中。

6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述含氮雜環(huán)化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一種或多種。

7.權(quán)利要求1所述的嗜吡啶紅球菌Rho48在制備微生物菌劑中的應(yīng)用。

8.一種微生物菌劑，其特征在于，所述微生物菌劑包括：嗜吡啶紅球菌Rho48;或所述微生物菌劑包括：嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4。

9.一種處理含氮雜環(huán)化合物廢水的方法，其特征在于，所述方法包括：向廢水中添加嗜吡啶紅球菌Rho48;或向廢水中添加嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4。

說明書

技術(shù)領(lǐng)域

[0001]本發(fā)明屬于廢水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及降解含氮雜環(huán)化合物的微生物及其在廢水處理中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

[0002]含氮雜環(huán)化合物是指分子中含有氮原子且氮原子作為雜原子參與形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，主要包括五元含氮雜環(huán)化合物吡咯、咪唑、吡唑和噻唑，六元含氮雜環(huán)化合物吡啶、嘧啶和吡嗪，苯并雜環(huán)化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和苯并咪唑，雜環(huán)并雜環(huán)化合物嘌呤和蝶啶等。其中，吡啶、吲哚、喹啉、苯并噻唑等是普遍存在焦化廢水等工業(yè)廢水中的難降解有機(jī)污染物，這些含氮雜環(huán)化合物因其致畸、致癌、致突變的特性，對環(huán)境和人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

[0003]常見含氮雜環(huán)化合物的處理工藝有：催化濕式氧化法、生物降解法和物理化學(xué)法。其中，生物降解法利用不同類型微生物的新陳代謝作用將含氮雜環(huán)化合物降解轉(zhuǎn)化成無機(jī)物，從而實(shí)現(xiàn)污染物的去除。生物降解法具有經(jīng)濟(jì)高效、無二次污染且作用條件相對溫和的特點(diǎn)，是目前含氮雜環(huán)化合物去除和轉(zhuǎn)化的有效方式。近年來，一些具有顯著降解含氮雜環(huán)化合物能力的功能菌株被分離和培養(yǎng)，如紅球菌、伯克霍爾德氏菌、假單孢菌、芽孢桿菌和副球菌等，這些降解菌株被認(rèn)為是強(qiáng)化去除含氮雜環(huán)化合物的潛在資源。

[0004]然而，在利用功能菌株處理含氮雜環(huán)化合物時發(fā)現(xiàn)，功能菌株對含氮雜環(huán)化合物具有特異性，單一降解菌株無法同時降解多種類型含氮雜環(huán)化合物，或者其能夠降解的含氮雜環(huán)化合物種類較少。例如，研究發(fā)現(xiàn)高效降解菌Bacillussp. L1在處理吲哚、喹啉、吡啶和3-甲基吲哚的復(fù)合污染時，其對吡啶和3-甲基吲哚無明顯降解作用。這可能是因?yàn)榻到饩険碛杏邢薜拇x途徑，僅能夠針對特定的一種或少數(shù)幾種含氮雜環(huán)化合物進(jìn)行降解。

[0005]在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)過程中，廢水中的含氮雜環(huán)化合物往往并非是孤立的一種。因此，提供更多降解含氮雜環(huán)化合物的微生物，以適應(yīng)不同的廢水處理顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

[0006]1. 要解決的問題

一方面，本發(fā)明針對降解含氮雜環(huán)化合物的微生物具有底物(含氮雜環(huán)化合物)特異性，從而導(dǎo)致含氮雜環(huán)化合物廢水處理受限的技術(shù)問題，提供一株新的降解含氮雜環(huán)化合物的微生物嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48，該微生物具有廣譜性，能夠降解至少包括喹啉、苯并噻唑或吡啶在內(nèi)的三種含氮雜環(huán)化合物。

[0007]另一方面，本發(fā)明還針對嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48降解吲哚效果不足的技術(shù)問題，提供另一株降解含氮雜環(huán)化合物的微生物赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4，將兩種微生物組合使用，形成復(fù)合菌群以提供更多的代謝途徑，提高了吲哚的降解效果。

[0008]2. 技術(shù)方案

為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏時間為2024年12月4號，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No.32892;該嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48篩選自無錫市政污水處理廠膜生物反應(yīng)器的活性污泥，具有廣譜性，能夠降解吲哚、喹啉、苯并噻唑或吡啶在內(nèi)的多種含氮雜環(huán)化合物，其中對喹啉、苯并噻唑和吡啶具有非常高的降解效率。

[0009]本發(fā)明還提供了上述嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48在處理含氮雜環(huán)化合物廢水中的應(yīng)用，嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48可以降解廢水中的含氮雜環(huán)化合物。

[0010]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，含氮雜環(huán)化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一種或多種。

[0011]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，含氮雜環(huán)化合物包括喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一種或多種。

[0012]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，含氮雜環(huán)化合物包括喹啉或苯并噻唑或吡啶。

[0013]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，還包括將嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4組合使用，赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏時間為2024年12月4號，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No.32891;嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4可以形成復(fù)合菌群，能夠進(jìn)一步提高廢水中的含氮雜環(huán)化合物的降解效果。

[0014]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，組合使用包括：將嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4分別制備成菌懸液;然后將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液混合后加入廢水中或者將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液分別加入廢水中;嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液分別加入廢水中，本發(fā)明對其加入的先后順序不做限制，可以是先加入嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液，也可以是先加入赤紅球菌Rho4菌懸液，也可以是兩種同時加入。

[0015]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，含氮雜環(huán)化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一種或多種。

[0016]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，含氮雜環(huán)化合物包括吲哚;與單個微生物降解相比，組合使用后能夠顯著提高吲哚的降解和礦化效果，推測是因?yàn)槭冗拎ぜt球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4形成復(fù)合菌群，發(fā)揮協(xié)同作用，提供了更多的代謝途徑。

[0017]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，廢水包括焦化廢水、印染廢水、制藥廢水和/或橡膠廢水等工業(yè)廢水。

[0018]本發(fā)明還提供一種赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏時間為2024年12月4號，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No.32891;該赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4篩選自無錫市政污水處理廠膜生物反應(yīng)器的活性污泥，該赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4能夠在一定程度上降解含氮雜環(huán)化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶;將其與嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48組合使用，能夠進(jìn)一步提高對含氮雜環(huán)化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶降解和礦化效果，尤其是含氮雜環(huán)化合物吲哚，能夠發(fā)揮嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4的協(xié)同作用，與單個微生物降解相比，顯著提高吲哚的降解和礦化效果。

[0019]本發(fā)明還提供了上述赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4在處理含氮雜環(huán)化合物廢水中的應(yīng)用，該應(yīng)用包括將赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4和嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48組合使用，降解廢水中的含氮雜環(huán)化合物。

[0020]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，組合使用包括：將嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4分別制備成菌懸液;然后將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液混合后加入廢水中或者將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液分別加入廢水中。

[0021]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，含氮雜環(huán)化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一種或多種。

[0022]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，含氮雜環(huán)化合物包括吲哚。

[0023]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用中，廢水包括焦化廢水、印染廢水、制藥廢水和/或橡膠廢水等工業(yè)廢水。

[0024]本發(fā)明還提供了上述嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4在制備微生物菌劑中的應(yīng)用。

[0025]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑包括：嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48。

[0026]本發(fā)明還提供了上述一種微生物菌劑在處理含氮雜環(huán)化合物廢水中的應(yīng)用。

[0027]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用包括：將嗜吡啶紅球菌Rho48制備成菌懸液;然后加入廢水中，嗜吡啶紅球菌Rho48可以降解廢水中的含氮雜環(huán)化合物。

[0028]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑包括：嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4，嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4分離包裝。

[0029]本發(fā)明還提供了上述一種微生物菌劑在處理含氮雜環(huán)化合物廢水中的應(yīng)用。

[0030]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用包括：將嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4分別制備成菌懸液;然后將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液混合后加入廢水中或者將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液分別加入廢水中，嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4可以形成復(fù)合菌群，能夠進(jìn)一步提高廢水中的含氮雜環(huán)化合物的降解效果。

[0031]本發(fā)明還提供了一種處理含氮雜環(huán)化合物廢水的方法，該方法包括：向廢水中添加上述嗜吡啶紅球菌Rho48。

[0032]進(jìn)一步地，上述方法中，將嗜吡啶紅球菌Rho48制備成菌懸液;然后加入廢水中，嗜吡啶紅球菌Rho48可以降解廢水中的含氮雜環(huán)化合物。

[0033]進(jìn)一步地，上述方法中，含氮雜環(huán)化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一種或多種。

[0034]進(jìn)一步地，上述方法中，含氮雜環(huán)化合物包括喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一種或多種。

[0035]進(jìn)一步地，上述方法中，廢水包括焦化廢水、印染廢水、制藥廢水和/或橡膠廢水等工業(yè)廢水。

[0036]本發(fā)明還提供了一種處理含氮雜環(huán)化合物廢水的方法，該方法包括：向廢水中添加上述嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4。

[0037]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用包括：將嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4分別制備成菌懸液;然后將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液混合后加入廢水中或者將嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液分別加入廢水中，嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4可以形成復(fù)合菌群，能夠進(jìn)一步提高廢水中的含氮雜環(huán)化合物的降解效果。

[0038]進(jìn)一步地，上述方法中，含氮雜環(huán)化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一種或多種。

[0039]進(jìn)一步地，上述方法中，含氮雜環(huán)化合物包括吲哚。

[0040]進(jìn)一步地，上述方法中，廢水包括焦化廢水、印染廢水、制藥廢水和/或橡膠廢水等工業(yè)廢水。

[0041]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用或方法中，嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液的制備包括：將嗜吡啶紅球菌Rho48接種于LB液體培養(yǎng)基中，35~40℃，150~250 rpm培養(yǎng)24~48 h。

[0042]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用或方法中，赤紅球菌Rho4菌懸液的制備包括：將赤紅球菌Rho4接種于LB液體培養(yǎng)基中，35~40℃，150~250 rpm培養(yǎng)24~48 h。

[0043]進(jìn)一步地，上述嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液或赤紅球菌Rho4菌懸液的制備，培養(yǎng)條件為37℃，180 rpm培養(yǎng)36 h。

[0044]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用或方法中，嗜吡啶紅球菌Rho48或赤紅球菌Rho4的接種生物量為：接種生物量為OD600=0.05~0.1。

[0045]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用或方法中，嗜吡啶紅球菌Rho48或赤紅球菌Rho4的接種生物量比為1:1。

[0046]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用或方法中，處理含氮雜環(huán)化合物廢水的溫度為35~40℃;pH為6.5~7.5;轉(zhuǎn)速為150~250 rpm;處理時間為0~72 h。

[0047]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用或方法中，處理含氮雜環(huán)化合物廢水的溫度為37℃;pH為6.5~7.5;轉(zhuǎn)速為180 rpm;處理時間為24~72 h。

[0048]進(jìn)一步地，上述應(yīng)用或方法中，處理時間為48~72 h。

[0049]3. 有益效果

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果在于：

(1)本發(fā)明提供的降解含氮雜環(huán)化合物的微生物及其在廢水處理中的應(yīng)用，該降解含氮雜環(huán)化合物的微生物為篩選自無錫市政污水處理廠膜生物反應(yīng)器的活性污泥的嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48，具有廣譜性，能夠降解和礦化吲哚、喹啉、苯并噻唑或吡啶在內(nèi)的多種含氮雜環(huán)化合物，尤其是對喹啉、苯并噻唑和吡啶具有非常高的降解和礦化效率，降解效率接近100%。

[0050](2)本發(fā)明提供的降解含氮雜環(huán)化合物的微生物及其在廢水處理中的應(yīng)用，該降解含氮雜環(huán)化合物的微生物為篩選自無錫市政污水處理廠膜生物反應(yīng)器的活性污泥的赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4，該赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4能夠在一定程度上降解和礦化含氮雜環(huán)化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶。此外，將其與嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48組合使用，兩者可以形成復(fù)合菌群，能夠進(jìn)一步提高對含氮雜環(huán)化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶降解和礦化效果，降解率均高達(dá)98%;尤其是含氮雜環(huán)化合物吲哚，能夠發(fā)揮嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4的協(xié)同作用，與單個微生物降解和礦化相比，顯著提高吲哚的降解和礦化效果。

[0051](3)本發(fā)明提供的降解含氮雜環(huán)化合物的微生物及其在廢水處理中的應(yīng)用，無論是嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48單獨(dú)使用，還是嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48與赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4組合使用，均能夠降解和礦化至少包括喹啉、苯并噻唑或吡啶在內(nèi)的三種含氮雜環(huán)化合物，使得處理含氮雜環(huán)化合物廢水，尤其是同時含有多種含氮雜環(huán)化合物的復(fù)合污染廢水時，具有更多選擇性。

附圖說明

[0052]圖1是本發(fā)明提供的單菌株嗜吡啶紅球菌Rho48和單菌株赤紅球菌Rho4對單一含氮雜環(huán)化合物的處理結(jié)果。

[0053]圖2是本發(fā)明提供的嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對單一含氮雜環(huán)化合物的降解結(jié)果。

[0054]圖3是本發(fā)明提供的嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對單一含氮雜環(huán)化合物的礦化結(jié)果。

[0055]圖4是本發(fā)明提供的嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染(吲哚10 mg/L+喹啉10 mg/L+吡啶10 mg/L)的處理結(jié)果。

[0056]圖5是本發(fā)明提供的嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染(吲哚25 mg/L +喹啉25 mg/L)的處理結(jié)果。

具體實(shí)施方式

[0057]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述。

[0058]除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同;本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

[0059]實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

[0060]如本文所使用，術(shù)語“約”用于提供與給定術(shù)語、度量或值相關(guān)聯(lián)的靈活性和不精確性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定具體變量的靈活性程度。

[0061]如本文所使用，術(shù)語“……任意一種或多種”旨在與“……中的一個或多個”同義。例如，“A、B和C中的任意一種或多種”明確包括僅A、僅B、僅C以及它們各自的組合。

[0062]濃度、量和其他數(shù)值數(shù)據(jù)可以在本文中以范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的范圍格式僅是為了方便和簡潔而使用，并且應(yīng)當(dāng)靈活地解釋為不僅包括明確敘述為范圍極限的數(shù)值，而且還包括涵蓋在所述范圍內(nèi)的所有單獨(dú)的數(shù)值或子范圍，就如同每個數(shù)值和子范圍都被明確敘述一樣。例如，約1至約4.5的數(shù)值范圍應(yīng)當(dāng)被解釋為不僅包括明確敘述的1至約4.5的極限值，而且還包括單獨(dú)的數(shù)字(諸如2、3、4)和子范圍(諸如1至3、2至4等)。相同的原理適用于僅敘述一個數(shù)值的范圍，諸如“小于約4.5”，應(yīng)當(dāng)將其解釋為包括所有上述的值和范圍。此外，無論所描述的范圍或特征的廣度如何，都應(yīng)當(dāng)適用這種解釋。

[0063]實(shí)施例1

本實(shí)施例提供嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4的分離與鑒定。

[0064](1)嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4的分離

用以富集降解含氮雜環(huán)化合物菌株的基質(zhì)取自無錫市政污水處理廠膜生物反應(yīng)器的活性污泥，通過梯度富集策略(增加含氮雜環(huán)化合物苯并噻唑濃度的同時減少葡萄糖濃度)獲得富集菌液。

[0065]所獲富集菌液，使用無菌超純水稀釋至10-4~10-7，吸取100 μL稀釋菌液均勻涂布在以葡萄糖為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5~7 d，挑取不同形態(tài)的單菌落在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線培養(yǎng)，以獲得純化菌株。其中：無機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖281 mg/L，NH4Cl 57.3 mg/L，KH2PO413.2 mg/L，MgSO4?7H2O 15 mg/L，CaCl2?2H2O 16.5 mg/L，MnCl2?4H2O 100 μg/L，F(xiàn)eSO4?7H2O 80 μg/L，ZnSO4?7H2O 40 μg/L，CuSO4?5H2O 20 μg/L，Na2MoO4?2H2O 20 μg/L，CoCl2?6H2O 10 μg/L。

[0066]純化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床37℃，180 rpm進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，備用。其中：LB培養(yǎng)基的組成為：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

[0067](2)嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4的鑒定

對上述純化后的菌株培養(yǎng)液用細(xì)菌16S rRNA基因序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物序列為：

27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.1);

1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTAYGACTT-3’(SEQ ID NO.2);

PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL 2 ×EasyTaq®PCR SuperMix(全式金，中國)、10.5 μL無菌無酶水、正向引物0.5 μL(10 μM)、反向引物0.5 μL(10 μM)和1 μL菌液;

PCR程序設(shè)定為：95℃預(yù)變性8 min;95℃變性20 s，55℃退火25 s，72℃延伸70 s，共循環(huán)32次;72℃延伸5 min。

[0068]將上述PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(Takara，日本)進(jìn)行純化，經(jīng)16SrDNA測序，所得核苷酸序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，在NCBI-nr數(shù)據(jù)庫中對上述序列進(jìn)行BLAST同源性比對。

[0069]結(jié)果表明，分離獲得的菌株分別為嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)，本發(fā)明中分別命名為嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Rho4。上述嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏時間為2024年12月4號，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號分別為CGMCCNo.32892和CGMCC No.32891。

[0070]序列SEQ ID NO.3(經(jīng)鑒定為嗜吡啶紅球菌)：

CGGGGGGGGGGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCGGGATGCATGTTCTGGGGTGGAAAGTTTTTCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCCCATGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTGGGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATCCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTCGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCCAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGTACCGGACGACTGCAGAGATGTGGTTTCCCTTGTGGCCGGTAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCTAACTCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGAGCCCCCCCC。

[0071]序列SEQ ID NO.4(經(jīng)鑒定為赤紅球菌)：

TTTGGGGGGGGGGCTTACCATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTACCGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGGTACAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGACCGCCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTCGTGGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCCGGCG。

[0072]實(shí)施例2

本實(shí)施例提供單菌株嗜吡啶紅球菌Rho48對單一含氮雜環(huán)化合物的降解實(shí)驗(yàn)，包括以下步驟：

(1)制備嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液

將嗜吡啶紅球菌Rho48接種于高溫高壓滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床37℃，180 rpm進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);36 h后菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，取出菌液8000×g離心2 min，棄上清液，使用PBS(磷酸鹽緩沖溶液)重懸沉淀菌體，上述操作重復(fù)3次;最后，使用無機(jī)鹽培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)重懸沉淀菌體，獲得嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液備用。

[0073](2)單一含氮雜環(huán)化合物的降解

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(同實(shí)施例1)先加入10 mg/L的單一含氮雜環(huán)化合物，分別為吲哚、喹啉、苯并噻唑和吡啶以模擬含氮雜環(huán)化合物廢水，再接種上述制備好的嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液，保證接種后生物量在OD600=0.05~0.1之間，最終建立100 mL的降解體系，調(diào)節(jié)體系pH在6.5~7.5之間。

[0074]降解條件為37℃，于磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速180 rpm形成好氧條件，處理時間為48h。

[0075]每個實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個重復(fù)，于0 h和48 h取樣檢測含氮雜環(huán)化合物濃度和總有機(jī)碳濃度(TOC)。

[0076]上述含氮雜環(huán)化合物濃度利用高效液相色譜(HPLC, 1260 Infinity Ⅱ,Agilent Technologies, USA)進(jìn)行測定，檢測器類型為紫外光源(DAD-3000, AgilentTechnologies, USA)，色譜柱為C18柱(4.6 × 250 mm, 5 μm, Agilent Technologies,USA)，檢測條件見下表1：

表1

[0077]TOC濃度依照《水質(zhì) 總有機(jī)碳的測定 燃燒氧化-非分散紅外吸收法》(HJ 501-2009)進(jìn)行測定。

[0078](3)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，嗜吡啶紅球菌Rho48對喹啉、苯并噻唑和吡啶的降解率高達(dá)98%左右，對于苯并噻唑和吡啶的礦化率在50%以上，具有一定的廣譜高效處理性能;但對吲哚的處理性能整體較弱，其降解率和礦化率均低于20%以下。

[0079]實(shí)施例3

本實(shí)施例提供單菌株赤紅球菌Rho4對單一含氮雜環(huán)化合物的降解實(shí)驗(yàn)，包括以下步驟：

(1)制備赤紅球菌Rho4菌懸液

將赤紅球菌Rho4接種于高溫高壓滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床37℃，180rpm進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);36 h后菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，取出菌液8000×g離心2 min，棄上清液，使用PBS(磷酸鹽緩沖溶液)重懸沉淀菌體，上述操作重復(fù)3次;最后，使用無機(jī)鹽培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)重懸沉淀菌體，獲得赤紅球菌Rho4菌懸液備用。

[0080](2)單一含氮雜環(huán)化合物的降解

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(同實(shí)施例1)先加入10 mg/L的單一含氮雜環(huán)化合物，分別為吲哚、喹啉、苯并噻唑和吡啶以模擬含氮雜環(huán)化合物廢水，再接種上述制備好的赤紅球菌Rho4菌懸液，保證接種后生物量在OD600=0.05~0.1之間，最終建立100 mL的降解體系，并調(diào)節(jié)體系pH在6.5~7.5之間。

[0081]降解條件為37℃，于磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速180 rpm形成好氧條件，處理時間為48h。

[0082]每個實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個重復(fù)，于0 h和48 h取樣檢測含氮雜環(huán)化合物濃度和總有機(jī)碳濃度(TOC)。

[0083]含氮雜環(huán)化合物和TOC濃度的檢測方法同實(shí)施例2。

[0084](3)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，赤紅球菌Rho4對上述四種含氮雜環(huán)化合物的降解性能和礦化能力均較低，較突出的吡啶組，降解率仍低于40%以下，礦化率也低于20%。

[0085]實(shí)施例4

本實(shí)施例提供嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對單一含氮雜環(huán)化合物的降解實(shí)驗(yàn)，包括以下步驟：

制備單菌株菌懸液嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液制備同實(shí)施例2;赤紅球菌Rho4菌懸液制備同實(shí)施例3。

[0086](2)單一含氮雜環(huán)化合物的降解

區(qū)別實(shí)施例2或3中接種單菌株嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液或赤紅球菌Rho4菌懸液，本實(shí)施例在各模擬含氮雜環(huán)化合物廢水中(同實(shí)施例2或3)分別接種嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液，嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4等比例接種，且保證接種生物量均在OD600=0.05~0.1之間，體系中其它組成、降解條件及含氮雜環(huán)化合物和TOC濃度的檢測均同實(shí)施例2或?qū)嵤├?。

[0087](3)結(jié)果分析

嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對單一含氮雜環(huán)化合物的降解結(jié)果如圖2所示，在48 h的降解時間內(nèi)，對單一含氮雜環(huán)化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和吡啶的降解率均超過98%，相較于實(shí)施例2和實(shí)施例3中單菌株降解效果，組合使用進(jìn)一步提高對含氮雜環(huán)化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶降解效果，具有更廣譜高效的處理能力，能夠滿足更多種含氮雜環(huán)化合物接近100%去除的需求。

[0088]嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對單一含氮雜環(huán)化合物的礦化結(jié)果如圖3所示，對于喹啉礦化率在50%左右，對于吲哚、苯并噻唑和吡啶的礦化率最高可達(dá)84%左右，相較于單菌株的處理，礦化效果也均有顯著的提高。

[0089]上述結(jié)果表明，嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用能夠有效實(shí)現(xiàn)對含氮雜環(huán)化合物母體及降解過程中產(chǎn)生的中間體的共同轉(zhuǎn)化，這一結(jié)果可能源于嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4在廢水中形成復(fù)合菌群，發(fā)揮兩者的協(xié)同作用。尤為突出的是，相較于單菌株Rho48或Rho4對于吲哚的低降解低礦化，組合使用其降解率和礦化率均得到了明顯的提升。

[0090]實(shí)施例5

本實(shí)施例提供嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染廢水的處理。

[0091]在本實(shí)施例中，為評估該復(fù)合菌群對廢水中含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染的處理能力，本實(shí)施例模擬焦化廢水中含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染的情況。

[0092]在本實(shí)施例中，模擬焦化廢水的制備包括：在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(同實(shí)施例1)先加入各含氮雜環(huán)化合物，最終模擬焦化廢水為：

A：10 mg/L吲哚+10 mg/L喹啉+10 mg/L吡啶;

B：25 mg/L吲哚+25 mg/L喹啉。

[0093]嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染廢水的處理包括以下步驟：

制備單菌株菌懸液嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液制備同實(shí)施例2;赤紅球菌Rho4菌懸液制備同實(shí)施例3。

[0094]含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染的降解參考實(shí)施例4，在模擬焦化廢水中分別接種嗜吡啶紅球菌Rho48菌懸液和赤紅球菌Rho4菌懸液，嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4等比例接種，且保證接種生物量均在OD600=0.05~0.1之間，體系中其它組成、降解條件及含氮雜環(huán)化合物和TOC濃度的檢測均同實(shí)施例2或?qū)嵤├?，處理時間延長至72 h;于0 h、24 h、48 h及72 h取樣檢測含氮雜環(huán)化合物和TOC濃度。

[0095]結(jié)果分析嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4組合使用對模擬焦化廢水A中三種含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染的處理結(jié)果如圖4所示，48 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)吲哚和喹啉的完全降解;72 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)吡啶的完全降解，72 h內(nèi)整體礦化效果接近50%左右;對模擬焦化廢水B中兩種含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染的處理結(jié)果如圖5所示，在吲哚和喹啉濃度提升至25 mg/L后，72 h內(nèi)該復(fù)合菌群依然能夠?qū)崿F(xiàn)吲哚和喹啉的接近100%降解。

[0096]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明中的嗜吡啶紅球菌Rho48和赤紅球菌Rho4具有良好的處理實(shí)際廢水中含氮雜環(huán)化合物復(fù)合污染的應(yīng)用潛能，可以單獨(dú)使用嗜吡啶紅球菌Rho48，或者將其與赤紅球菌Rho4組合使用，能夠?qū)Χ喾N含氮雜環(huán)化合物的復(fù)合污染進(jìn)行高效降解和礦化。

說明書附圖(5)